颠茄胚性悬浮细胞遗传转化系的研究

【摘要】本研究以颠茄无菌苗为材料,运用植物组织培养技术,建立颠茄胚性细胞的悬浮培养系并诱导胚性悬浮细胞的再生植株,在此基础上选用颠茄的胚性悬浮细胞团作为遗传转化的受体,通过对农杆菌(C58C1-pCAMBIA1304-Abpmt)介导颠茄胚性细胞的转化条件的筛选,建立其遗传转化体系,经潮霉素等抗性筛选和分子检测获得其转基因的毛状根。探究农杆菌介导颠茄胚性悬浮细胞遗传转化的条件,并阐明pmmt基因在颠茄TAs生物合成途径中的作用,为培育TAs高产的颠茄新品系提高一条新途径。主要研究结果如下：1.颠茄愈伤组织诱导条件的优化。以颠茄叶片、叶柄、茎做外植体,MS为基本培养基,通过比较不同激素配比对颠茄叶片、叶柄、茎的愈伤组织诱导的影响,发现最宜的愈伤诱导激素配比分别为：2.0mg-L-16-BA+0.2mg.L-1NAA(叶片),2.0mg.L-12,4-D(叶柄),3.0mg-L-16-BA+0.1mg.L-1NAA(茎段),以叶片的诱导效果最好,其愈伤生长旺盛,颜色鲜艳且质地紧密。2.颠茄胚性愈伤的诱导。以颠茄叶片为外植体,接入UM(UMO+2.0mg-L-12,4-D+0.25mg.L”’KT)培养基中直接诱导胚性愈伤,挑选出的胚性愈伤在附加2.0mg·L-12,4-D的MS培养基中继代、纯化2-3个月后,初始愈伤可转变为浅黄色、颗粒状、生活力强的松脆型胚性愈伤组织,即用于悬浮培养系的建立。3.颠茄胚性细胞悬浮系的建立和植株再生。通过正交试验得出颠茄胚性细胞悬浮培养的条件：培养基为MS+2.0mg.L-12,4-D+0.25mg-L-1KT,0.5mL接种量,200mL三角瓶中加入50mL培养基,10d继代一次。颠茄胚性细胞经悬浮培养2-3个月后,可获得生长旺盛、增殖迅速、色泽亮黄、结构致密的胚性细胞团。继代5次以上的胚性悬浮系中体胚发生率在40.9%以上,体胚萌发率为84.36%,颠茄胚性悬浮细胞的再生植株经炼苗移栽,其成活率达95%以上。4.农杆菌介导颠茄胚性悬浮细胞的遗传转化的影响因素确定。采用单因子实验对农杆菌菌液浓度、浸染时间、共培养时间和共培养基中AS的浓度4个因素进行研究,通过比较gus基因的瞬时表达率,确定农杆菌介导颠茄胚性悬浮细胞团的转化条件为：工程菌C58C1-pCAM1304+-Abpmt菌液浓度OD600=0.5-0.6,浸染时间为20mmin,乙酰丁香酮(AS)的最佳浓度为100μm01·L-1,共培养2d。5.抗性愈伤组织及转基因发根的获得。在农杆菌介导的颠茄胚性悬浮细胞的遗传转化中,农杆菌的抑菌选用400mg-L’1Carb,抗性筛选先使用10mg.L-1Hygr培养2周后,选择压再增加至15mg·L-1。共获得21个拟转化发根系,经PCR检测后获得7个阳性单克隆发根系。6.转基因发根系中TAs含量的检测。颠茄单克隆发根系中TAs含量的HPLC分析显示：有5个转基因颠茄发根系的东莨菪碱与莨菪碱的含量都有显著提高,且东莨菪碱的平均增涨幅度高于莨菪碱；在最优发根系中总TAs含量比野生型无菌苗根提高了3.3倍,东莨菪碱含量为野生型无菌苗根的3.7倍,莨菪碱含量为野生型对照的2.6倍。
【作者】李姣姣；
【导师】吴能表；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】颠茄；胚性细胞；1,4-丁二胺-氮-甲基转移酶；遗传转化；托品烷类生物碱；

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